Генетический анализ похож на кулинарию. И там и там есть строгий рецепт, от которого нельзя отклоняться. И там и там получившийся пирог ничем не напоминает начальные два стакана муки, три ложки сахара и желток куриного яйца. И там и там результат зависит сразу и от техники, и от тех, кто ею управляет, и от исходного сырья. В общем сходств много. Но генетическое «блюдо» — особенно когда речь идет об анализе ДНК методом NGS (next-generation sequencing, секвенирование нового поколения) — гораздо удивительнее и сложнее в приготовлении. Поэтому описание процесса пришлось разделить на несколько частей. В кулинарных книгах так тоже делают.

Часть первая: удаляем лишнее

Сырье:

94 пробирки со свежеразмороженной кровью потенциальных доноров костного мозга

Десяток флаконов с растворами

Техника:

Шейкер для пробирок — насаженная на ось планка с дырочками

Станция выделения нуклеиновых кислот — прибор с прозрачной крышкой

Мастер:

Шамиль, молодой человек в белом халате и голубых перчатках. Несколько лет назад закончил биофак Казанского федерального университета (КФУ) и теперь учится в магистратуре. В принципе его работу может сделать любой другой сотрудник лаборатории — здесь каждый умеет все

Небольшая комната с окошками, через которые принимают сырье и отдают готовый продукт. На столе станция, на другом — кассета с пробирками, наполненными кровью. Незадолго до начала процесса ее достали из холодильника. Шамиль вставляет пробирки одну за другой в шейкер, который начинает вращаться. Пока все понятно: перед готовкой продукт нужно как следует перемешать, чтобы не было сгустков и комков.

— Видите, кровь разного цвета, — объясняет Шамиль по ходу дела. — От долгого хранения она становится более темной. С такой кровью сложнее работать.

Через пару минут он вынимает пробирки из шейкера, переносит совсем чуть-чуть крови из каждой в другие, маленькие пробирки и закладывает их в станцию. Туда же в специальные гнезда он вставляет сосудики с какими-то жидкостями, закрывает крышку и нажимает «Пуск». Прибор начинает гудеть, щелкать и петь на разные голоса. Внутри что-то движется.

Я вижу через прозрачную крышку, как электронная рука берет пригоршню тонких наконечников, вставляет в пробирки с кровью и замирает, довольно гудя, — впрыскивает раствор. Удовлетворившись, вытаскивает наконечники, подносит к стеклянному лотку в стенке и выкидывает наружу — они одноразовые. А прибор продолжает трудиться — доливает растворы, переставляет пробирки с места на место, длинным шлангом отсасывает отходы. Смысл всей этой суеты теперь в том, чтобы убрать из пробирок остатки разрушенных молекул и оставить там только нити ДНК в специальном растворе.

— В каждой пробирке теперь 100 микролитров раствора ДНК, — говорит Шамиль, — капелька диаметром 5 мм. Сверху ее запечатывают маслом. Как соту с медом.

Вот так за каких-то два часа станция превращает кровь с ее эритроцитами, лейкоцитами, тромбоцитами, антителами и бог знает чем еще в идеальное чистейшее сырье — ДНК, генетические буквы, собранные в цепочки-ниточки. То же — хоть мне посмотреть не удалось — станция может делать и с буккальным эпителием.

Этап второй: размножаем нужное

Сырье:

94 пробирки с ДНК

Раствор с так называемыми праймерами

Другие растворы

Техника:

Амплификатор — прибор для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с экраном, показывающим график изменения температуры. Внешне напоминает хлебопечку

Мастер:

Шамиль

Мы уже в другой комнате, рядом с первой, — пробирки сюда передали через окошко в стене. Шамиль смешивает праймеры с другими растворами, потом с ДНК и все это загружает в «хлебопечку». Внутри ничего не видно, остается верить словам Шамиля. Вот что он рассказывает. Теперь уже на кусочки распадаются сами нити ДНК. В каждой пробирке оказываются обломки 20 тысяч имеющихся у человека генов. И тут в дело вступают праймеры. Среди множества обломков они находят кусочки генов тканевой совместимости (они называются HLA), садятся на них и прямо так, сидя на них, создают их точную копию. Потом копия и оригинал разлепляются, и цикл размножения повторяется.

Чтобы процесс шел быстро и правильно, амплификатор должен периодически нагревать и охлаждать свое содержимое гораздо более умело, чем хлебопечка, — с точностью до 0,1 градуса.

— Я думаю, эта работа как раз для биолога, не для врача, — говорит Шамиль. — На биофаке я работал с бактериями и много занимался выделением ДНК, так что хорошо понимаю принцип. Только там у нас было всего несколько колоний бактерий, все делали вручную, а тут производственные масштабы. Надо было запомнить последовательность действий и набить руку. Сколько времени для этого нужно? Ну недельку потренироваться.

Теперь у нас есть множество кусочков нужных нам генов HLA. Нуклеотиды, из которых они состоят, можно даже разглядеть в электронный микроскоп. Но их в каждой пробирке триллионы — как все это прочесть?

Этап третий: читаем гены

Сырье:

94 пробирки с кусочками генов тканевой совместимости

Специальные светящиеся молекулы-метки разных видов

Техника:

Секвенатор MiSeq — прибор для чтения генов. Главный герой в приготовлении генетического блюда. На вид — еще одна пластиковая коробка с небольшим, как у старых телевизоров, экраном

Мастер:

Гульназ, худенькая скромная выпускница биофака КФУ

Мы с Гульназ в следующей, третьей комнате и готовимся к запуску самого главного прибора. Она в лаборатории четвертый месяц. Испытательный срок прошла, работой довольна, но все-таки ощущает себя новенькой и немного стесняется рассказывать. Постараюсь передать суть.

Изучать по очереди содержимое каждой пробирки — значит почти в сто раз увеличить время работы. Но, с другой стороны, если их смешать, получится каша, в которой уже никогда не поймешь, где чей ген. Поэтому Гульназ «составляет библиотеку» — из пипетки накапывает в каждую пробирку раствор со светящимися молекулами-метками, которые садятся на кончик каждого обломка ДНК.

То, что происходит дальше, по-прежнему приводит Гульназ в радостное возбуждение даже на четвертый месяц работы.

— Только представьте, я сливаю все 94 пробирки вместе, — говорит она. — Теперь в этом миллилитре, который у меня в руках, содержится информация о сотне людей! Я первое время, когда приходила с работы, все время говорила об этом с мужем, очень хотелось поделиться. Но он не впечатлился — политолог, другие интересы.

Секвенатор вчетверо мощнее предыдущих приборов — он может читать гены сразу 376 человек. Как духовка, куда ставят сразу несколько противней с разными блюдами. Поэтому, прежде чем его запускать, Гульназ четырежды составляет библиотеки, полученные от четырех запусков предыдущих приборов. Получаются четыре маленькие пробирки, которые она, не переставая удивляться, тоже сливает вместе. И загружает в секвенатор. А в дополнение к ним — светящиеся (это она так сказала, я свечения не вижу) нуклеотиды.

На такую дорожку, находящуюся где-то в недрах прибора, прилепляются своими кончиками кусочки ДНК — как колония червячков-трубочников, которые зарываются одним концом в ил, а другой выставляют наружу.

Каждый «червячок» — это обрывок генетического слова, составленный из генетических букв. Их в нем от нескольких десятков до нескольких сотен. Сам алфавит простой, всего четыре буквы — A, G, C и T. Это нуклеотиды аденин, гуанин, цитозин и тимин. Они так устроены, что в двойной нити ДНК всегда образуют пары — аденин с тимином, гуанин с цитозином. В секвенаторе именно это и используется — к каждому «червячку» буква за буквой пристраивается сбоку парный «червячок», составленный из светящихся нуклеотидов. Все четыре светятся по-разному: по свечению можно узнать, какие они и, соответственно, к кому пристроились. Секвенатор читает прилепившихся к дорожке «червячков», смывает их, и прилепляется новая порция. А прибор записывает и записывает на свой жесткий диск последовательности букв. Совершенно бессмысленные — это ведь не гены, а их обломки.

Этап четвертый: понимаем прочитанное

Сырье:

Информация на жестком диске

Техника:

Компьютер

Мастер:

Шамиль

С каждой следующей комнатой чтение генетического кода становится все более далеким от живой природы. Теперь у нас нет ни крови, ни ДНК, ни нуклеотидов. Только записанные на жесткий диск буквы.

— Снимаем данные с MiSeq и переносим на компьютер, — объясняет Шамиль. — И дальше специальная программа будет их анализировать. Сейчас запущу, к утру будет готово.

Цель — из обломков воссоздать целое, из кусочков суперпазла сложить картинку. В лаборатории анализируется пять генов тканевой совместимости, и на выходе из MiSeq каждый из них представлен тысячами обломков. Понятно, что, для того чтобы правильно их сложить, надо знать, какими вообще эти гены бывают, какие у них варианты — аллели. Вот этим компьютер целую ночь и будет заниматься: составлять из обломков цепочки и сравнивать с уже известными аллелями. Завтра все множество обломков гена HLA-A сведется к тому, что этот ген представлен у донора, например, аллелем под названием А*02:67 (здесь я рассказывал, что значат эти цифры). Так же определятся и остальные четыре гена — HLA-B, C, DR и DQ. Кровь превратится в набор из нескольких букв и цифр — чтобы тот, кто ее сдал, смог когда-нибудь стать донором для другого человека с тем же набором.

— Мне тут интересно, потому что я вижу, какие люди у нас живут, с какими аллелями, — говорит Шамиль. — На самом деле я еще только начинаю все это понимать, глаз еще не наметан. А те, кто давно работает, могут взглянуть на генотип HLA и сразу сказать: вот этот, скорее всего, с Кавказа, а этот наш, казанский.

Человек пока все-таки умнее компьютера. Часто случается, что несколько вариантов складывания пазла оказываются равновероятными и компьютер подает сигнал: не могу решить, как правильно. Тут в дело вступает человек — Шамиль, Гульназ, кто-то еще из пятерых сотрудников, занятых чтением генов, или руководитель лаборатории Елена Шагимарданова.

— Поначалу это немного напрягает, — признается Шамиль, — если компьютер помечает какой-то вариант как новый, приходится прежде всего проверять, нет ли тут технической ошибки. А вот если ошибки нет — это радость. Значит, мы открыли новый аллель. Подадим его в международную базу данных, сделаем по нему публикацию. А если такой аллель обнаружится у нескольких людей, еще лучше: можно выстраивать связи, определять региональные особенности. Это же здорово! У нас работу на эту тему готовила одна моя коллега, но она ушла в декрет, теперь я этим занимаюсь.

Вот так, с одной стороны, просто, а с другой — совершенно удивительно и довольно-таки невероятно и происходит чтение наших генов в казанской лаборатории, созданной Русфондом для пополнения Национального регистра доноров костного мозга имени Васи Перевощикова. При полном секвенировании — это лаборатория тоже умеет — читают все гены, но для регистра достаточно пяти.

Напоследок посчитаем, сколько времени требуется на получение генотипа HLA 374 человек. В хорошей кулинарной книге такие данные всегда указывают.

Сначала приборная часть:

На выделение ДНК из 94 пробирок нужно примерно два часа, а для обработки четырех порций пробирок — соответственно, восемь. ПЦР для размножения генов в четырех порциях нужно шесть часов. Секвенатор, сердце системы, работает 48 часов. Компьютер — примерно 12. Итого 74 часа, чуть больше трех суток.

А вот людские «трудочасы»:

Если работать вдвоем, минут 40 уходит на подготовку пробирок для выделения ДНК. Два часа — на одну порцию ПЦР. По шесть часов — на создание каждой из четырех библиотек. Больше всего сил уходит на проверку результатов после компьютера — четыре рабочих дня, то есть 32 часа. Итого 69 часов на всю процедуру. Машинного времени не намного больше, чем человеческого. Но если бы машин не было, человеку на анализ такого же количества генов потребовалось бы в сотни и тысячи раз больше часов. А надеяться на такой же точный и детализированный результат, как при NGS, было бы не менее глупо, чем пытаться приготовить торт на костре.

Фото: Марат Хафизов