Определять совместимость донора и реципиента костного мозга не по удачному или плачевному результату операции, а заранее врачи начали сравнительно недавно – в конце 1960-х годов. Зато потом все стало развиваться стремительно.

Перфекционизм в генах

Определение генов тканевой совместимости называют типированием. Но прежде чем типировать, следовало обнаружить сам объект исследования. Это должно было случиться на рубеже 1860–70-х годов: швейцарский врач и биолог Иоганн Фридрих Мишер, исследуя, из каких белков состоит клеточное ядро, обнаружил там нечто на белок совсем не похожее. Это нечто он без затей назвал нуклеином («nucleus» – по-латыни «ядро»). Позже, погрузившись в изучение спермы лососевых рыб, Мишер начал понимать, что нуклеин может участвовать в передаче наследственной информации.

Но в Мишере, исследователе-провидце, неудачно сошлись перфекционизм и нерешительность. Он десятки раз повторял любой опыт, он во всем сомневался. Работы публиковал редко, писал осторожно и взвешенно – за бесконечными «возможно», «не исключено», «есть основания предполагать» его идею просто не заметили.

Мишер достоин отдельной статьи, но сейчас все же не о нем.

В 40-х годах XX века эксперименты на бактериях показали, что наследственная информация и правда передается с помощью того самого «нуклеина» – дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В 1950-х, благодаря в том числе Жану Доссе, стало понятно, что рычаги управления иммунитетом и отторжением тканей тоже находятся в ДНК. А вскоре возникла нужда в постановке таких исследований на поток: хирурги все активнее занимались трансплантацией, и проблема просто бросалась в глаза.

В конце 1950-х знаменитый доктор Дон начал массовые опыты по трансплантации костного мозга. Из сотни пациентов, которым он сделал пересадку, всего 13 прожили больше года и ни один – больше четырех с половиной лет. Было над чем работать дальше.

Смерть в миниатюре

Первым и наиболее очевидным способом изучения иммунитета отдельно взятого человека было серологическое типирование, то есть исследование сыворотки крови. Это давний метод, применявшийся по крайней мере с XIX века. Только на этот раз сыворотка оказалась не объектом изучения, а инструментом – реагентом.

С помощью нее исследуют лимфоциты, полученные из крови испытуемого. Лимфоциты смешивают с разными сыворотками, каждая из которых содержит некоторый набор антител. Каждое антитело настроено на определенный антиген – белок, вырабатываемый генами тканевой совместимости. Если антитело и антиген между собой реагируют, лимфоцит погибает, и это можно разными способами обнаружить.

Все это выглядит запутанно, поэтому приведу такой пример. Представьте, что перед вами большая коробка. Вы знаете, что внутри нее то ли мышь, то ли кочан капусты, то ли пшеничные зерна. Но только не знаете, что именно из этого набора. Коробка закрыта, в ней есть небольшая дырка. Как определить содержимое? Мы взвешиваем коробку, а затем по очереди запускаем в нее кошку, кролика и воробья. После посещения каждого из животных снова взвешиваем. Если после кролика вес остался тот же, а после кошки уменьшился – значит, внутри сидела мышка. А теперь уже не сидит.

Мышь, капуста и зерна – это антигены, продукты генов тканевой совместимости, которые мы хотим определить. Кошка и другие – это атакующие их антитела.

Система, конечно, не без недостатков. Гены тканевой совместимости крайне разнообразны, их тысячи вариантов. Почти так же разнообразны и производимые ими антигены.

Мы не узнаем, какая мышка сидела в коробке – домовая, полевая или лабораторная. Кошка одинаково сожрет любую. Еще одна из многих проблем – кросс-реакции. Кролик вместо капусты может сдуру съесть зерно.

У серологического типирования было немало возможностей совершенствоваться. Можно расширять гамму сывороток, специальным образом их активировать, то есть, условно говоря, не кормить животных перед опытом, чтобы они хорошенько проголодались. Можно для ускорения эксперимента подбирать подходящие комбинации для одновременного тестирования – воробья объединить с кроликом (не с кошкой).

Но всех проблем так не решить. И вообще серология позволяет узнать свойства молекулы, а не увидеть ее устройство.

Два «Нобеля» на одного

За время существования Нобелевской премии лишь четыре человека сумели получить ее дважды. И только Фредерик Сенгер – дважды по химии. Первая была за секвенирование (полное определение структуры) инсулина. Вторая – за изобретение метода секвенирования, который теперь так и называется – метод Сенгера. Позже он был сильно усовершенствован, но по сути значительная часть типирований до сих пор происходит «по Сенгеру».

Группа под его руководством научилась читать генетические буквы во второй половине 1970-х годов. Суть идеи в том, чтобы использовать естественный процесс удвоения – репликации ДНК. Для этого в образец добавляется, во-первых, праймер – белок, который «садится» на начало интересующего нас фрагмента и дает старт удвоению. Во-вторых, полимераза – молекула-механизм для удвоения. И в-третьих, нуклеотиды – строительный материал. Их четыре: аденин, гуанин, цитозин, тимин.

Однако помимо обычных нуклеотидов Сенгер добавил в эту адскую смесь небольшое количество нуклеотидов слегка измененных. На них была флуоресцентная метка, и они были так устроены, что сами могли стать кирпичиками строящейся молекулы, но следующие кирпичики присоединиться к ним уже не могли. Всякая цепочка, в которую попадал меченый кирпичик, прекращала расти. Так образовывались цепочки всего из одного нуклеотида, из двух, трех, четырех… У каждой на конце – светящийся нуклеотид, причем известно какой, потому что все четыре светятся по-разному. Понятно, что, если рассортировать цепочки по длине, можно определить полную последовательность всего исследуемого участка.

Поколение Next

Методу Сенгера здорово помогает полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая размножить исследуемый участок. Об открывателе ПЦР Кэри Муллисе мы тоже писали. Но, кажется, славных имен в истории типирования больше не будет. В действие вступил коллективный разум.

Как? Можно, например, анализировать сразу несколько участков ДНК. А можно поступить хитрее: исследовать в одной пробирке гены сразу многих людей. Чтобы их не спутать, ДНК каждого человека помечают специальной меткой, по которой можно будет потом опознать принадлежность фрагмента. Обработать результаты будет, конечно, сложнее, но в сравнении с выгодами это пустяк.

В статье «280 человек в одной пробирке» Кровь5 рассказывала о том, как это работает. Способов ускорить метод Сенгера много, и все они называются next-generation sequencing (NGS, по-русски – секвенирование нового поколения). Именно этим методом сейчас в основном типируют доноров костного мозга. Его использует и лаборатория Русфонда при Казанском федеральном университете. Он позволяет типировать доноров быстро, дешево и в высоком разрешении. Но что дальше?

Кому больше всех нано

Вообще идея секвенирования еще более новаторского, чем NGS, появилась относительно давно – в конце 1990-х. Называется оно third-generation sequencing (TGS, по-русски – секвенирование третьего поколения). Сама схема выглядит даже проще, чем NGS и серология.

А пока они ползут, дырочки с помощью «встроенного регистратора» опознают и запоминают каждый их сегмент – нуклеотид. Молекулу ДНК не нужно размножать, не нужно резать на очень мелкие части, придумывать какие-то светящиеся метки… Странно, что такое раньше не придумали, не так ли?

Но у простой схемы – множество технических проблем, пока не решенных. «Чтение» происходит с помощью электрического тока. Мембрана – диэлектрик, ток проходит через поры. Когда пору перекрывает очередной нуклеотид, ток уменьшается. По тому, насколько он уменьшился, можно узнать, который из четырех нуклеотидов проходит через пору прямо сейчас. Только вот дырочки, созданные из естественных или синтетических белков, – очень нежные образования, которые быстро меняют свои свойства, из-за этого TGS дает много ошибок, а менять мембрану – недешевое удовольствие. Молекулы ДНК проходят через поры слишком быстро, и при интерпретации электрических сигналов возникают дополнительные ошибки.

Удастся ли все это исправить? Насколько перспективен такой метод для медицины? В России уже есть компании, использующие TGS. Кровь5 связалась с одной из них и в скором времени расскажет об этом методе подробнее.